Les prélèvements pour analyse PCR

C’est une méthode de recherche d’un pathogène par l’amplification d’une partie de son patrimoine génétique.
C’est une technique sensible aux facteurs d’inhibition de la réaction.
La qualité des prélèvements impacte directement le résultat des analyses.
Le respect des consignes décrites ci-dessous est nécessaire pour garantir la qualité des analyses.

Il est possible dans certains cas de traiter des mélanges d’échantillons (par exemple, mélanges intra- ou inter-cheptels de sang) ou des échantillons de mélanges (par exemple, lait de tank). Les conditions de ces mélanges sont précisées pour les recherches concernées.

La norme NF U47-600-1 précise en particulier que « La restitution des résultats acquis à partir du mélange d’une même matrice (provenant d’animaux différents appartenant ou non à un même cheptel ou unité épidémiologique), ou acquis à partir de mélange de matrices différentes (provenant ou non d’un même sujet), est possible. » Mais « le résultat obtenu à partir d’un mélange de prélèvements ne présage pas des résultats qui seraient obtenus à partir d’analyses individuelles. »

Expression des résultats:

Résultat négatif ou non détecté => Absence de détection du génome recherché
Résultat positif ou détecté => Détection du génome recherché
Résultat positif faible => Limite de détection : le génome recherché est trouvé en faible quantité
Inhibé => On ne peut garantir que la qualité de l’échantillon a permis le bon déroulement de la réaction
Ininterprétable => pour les autres cas

Les résultats positifs peuvent être catégorisés en POSITIF et POSITIF FORT pour faciliter la gestion de ces résultats par le GDS (groupement de défense sanitaire). Les critères de tri sont des seuils de gestion. Vous pouvez demander plus d’information auprès du laboratoire ou du GDS du Doubs.

Prélèvements : Sang, lait individuel, lait de tank, biopsie de tissus

Le respect de ces consignes est nécessaire pour garantir la qualité des analyses

Sang sur anticoagulant EDTA

Les prélèvements de sang peuvent faire l’objet d’analyses de mélange inter- ou intra-cheptel.
Les mélanges sur sang sont composés de 2 à 10 animaux au maximum

• QUANTITE MINIMALE : 2 ml
• DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION : < 8jours => 5°C+/-3°C
• Ne pas congeler

Le respect de ces consignes est nécessaire pour garantir la qualité des analyses

Lait individuel ou de tank

Conditions Optimales de réalisation du prélèvement de lait de tank :

• le tank doit contenir au minimum 2 traites consécutives
• agiter le lait de tank pendant environ 30 secondes
• prélever à l’aide d’une louche propre (le flacon avec conservateur ne doit pas être plongé dans le tank)
• bien fermer et homogénéiser le contenu du flacon par retournements pendant 15 secondes
• identifier le prélèvement avec le numéro de cheptel et la date
• Le conservateur peut-être du bronopol
• QUANTITE MINIMALE : 20 ml

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• < 48 heures sans conservateur => 5°C+/-3°C
• < 8jours => 5°C+/-3°C
• sinon congeler à – 20°C

Flacon avec conservateur disponible sur demande au laboratoire.
Le respect de ces consignes est nécessaire pour garantir la qualité des analyses

Cartilage auriculaire

La biopsie est faite à l’aide d’une boucle préleveuse.
Le cartilage est à l’intérieur du trocart, protégé au-dessus par un opercule métallique et en-dessous par un tube plastique hermétiquement clipsé. Le tout est enfermé dans un sachet plastique dans une enveloppe portant la date de prélèvement.
Cette date est importante pour l’interprétation des résultats.

Les prélèvements d’oreille peuvent faire l’objet d’analyse de mélange inter- ou intra-cheptel.
Les mélanges sont composés de 2 à 20 animaux au maximum

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

le délai optimal est < 7 jours dans les conditions d’envoi standard (Température ambiante)
Au delà de 7 jours, le délai est considéré est important et fait l’objet d’une réserve sur le rapport d’analyse
Au delà de 15 jours, aucune biopsie ne sera mise en analyse

Le respect de ces consignes est nécessaire pour garantir la qualité des analyses.

Tissu

Ne pas ajouter de liquide.
Le prélèvement de choix en BVD est toujours le sang sur EDTA. Les organes sont des prélèvements souvent moins intéressants (risque d’inhibition plus important, problèmes de fraîcheur). La rate, le poumon ou la peau sont le plus fréquemment utilisés.

QUANTITE MINIMALE : 5 grammes

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

< 24 heures => 5°C+/-3°C
> 24 heures => – 20°C

Le respect de ces consignes est nécessaire pour garantir la qualité des analyses.

Cette analyse permet une mise en évidence directe du germe avec une excellente sensibilité. Cependant, elle nécessite une excellente qualité du prélèvement.

Prélèvements : Placenta, écouvillon vaginal ou endocervical, mucus, liquide stomacal foetal, lait individuel, lait de tank

Placenta

Prendre les cotylédons les plus lésés. Ne pas ajouter de liquide.

QUANTITE MINIMALE : 1 cotylédon

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• < 24 heures => 5°C+/-3°C
• > 24 heures => – 20°C

Ecouvillon vaginal ou endocervical sans milieu de transport

Frotter énergiquement la muqueuse pdt 10 sec. Ne pas ajouter de liquide.

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• < 24 heures => 5°C+/-3°C
• > 24 heures => – 20°C

Lait individuel ou de tank (mélanges de 50 bêtes au maximum) (avec bronopol, de préférence)

Conditions Optimales de réalisation du prélèvement de lait de tank :

• le tank doit contenir au minimum 2 traites consécutives
• le nombre de vaches traites ne doit pas excéder 50
• agiter le lait de tank pendant environ 30 secondes
• prélever à l’aide d’une louche propre (le flacon avec conservateur ne doit pas être plongé dans le tank)
• bien fermer et homogénéiser le contenu du flacon par retournements pendant 15 secondes
• identifier le prélèvement avec le numéro de cheptel et la date

QUANTITE MINIMALE : 20 ml

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• < 8jours => 5°C+/-3°C
• au delà => – 20°C

L’envoi par la poste ne permet pas de garantir une qualité optimale. Il est fortement recommandé de passer par un transporteur (éleveur, LVD…).

L’analyse étant réalisée en fonction de la demande, il est souhaitable de nous prévenir quand il y a des contraintes particulières (nombre d’échantillons ou délai…), afin de planifier le prélèvement, l’envoi, la réception et l’analyse.

Le respect de ces consignes est nécessaire pour garantir la qualité des analyses.

Prélèvements : Sang, organes

Sang sur anticoagulant EDTA

Ne pas congeler

QUANTITE MINIMALE : 2 ml

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• Conservation à 5°C+/-3°C
• Entre Prélèvement et Réception au laboratoire = 5 jours
• Au delà, le prélèvement peut être considéré comme dégradé et le résultat rendu « Sous réserve »

Organes

Dans le cas d’avorton ou d’animaux morts, l’analyse peut être effectuée à partir de la rate ou éventuellement foie ou coeur

QUANTITE MINIMALE : 5 grammes

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• < 24 heures => 5°C+/-3°C
• > 24 heures => – 20°C

Le respect de ces consignes est nécessaire pour garantir la qualité des analyses.

L’analyse n’est pas réalisée chaque semaine, notamment en période estivale. Si le résultat est urgent, il est conseillé d’appeler le LVD pour connaître le jour de la prochaine analyse.

Prélèvements : Fèces

Fèces

QUANTITE MINIMALE : 10 grammes

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION => STOCKAGE :

• < 7jours => 5°C+/-3°C
• > 7 jours => – 20°C

Dans le cas d’un plan de lutte:

• les coupelles doivent être conservées à l’abri de la poussière
• En cas de plan de lutte, un DAP doit être demandé à l’avance au GDS pour pouvoir identifier les échantillons à l’aide des étiquettes code-barres. Prévenir le LVD 25 tél : 03.81.25.88.50 – mail lvd25@doubs.fr pour définir la date de prélèvement et le nombre approximatif de fèces
• le jour des prélèvements :
  • § ne pas utiliser de lubrifiant, ni de gant avec talc pour prélever
  • § ne pas chercher à faire saigner
  • § mettre un échantillon d’environ 20 g dans une coupelle et l’identifier à l’aide des étiquettes code-barres au niveau du fond (et non sur les couvercles qui peuvent être inversés ou sur la face latérale qui ne permet pas de scanner le code)
• une fois les prélèvements réalisés, les transmettre au LVD 25 au plus vite, afin qu’ils arrivent au plus tard le jeudi avant 15h (les échantillons doivent être pris en charge dès leur arrivée au LVD)

Le respect de ces consignes est nécessaire pour garantir la qualité des analyses.

La PCR permet une mise en évidence directe du germe avec une excellente sensibilité.
Elle ne permet pas de typer la salmonelle. Seule la culture permet d’isoler la souche qui peut alors être identifiée précisément et être soumise à un antibiogramme.

La méthode n’est validée que pour des échantillons individuels.
Il convient de préciser le contexte (clinique ou portage, …) lors de la demande et si un traitement antibiotique préalable a été administré.

Prélèvements : Placenta, mucus génital, fèces, lait individuel, liquide fœtal, écouvillon endocervical

Placenta

Prendre les cotylédons les plus lésés. Ne pas ajouter de liquide.

QUANTITE MINIMALE : 1 cotylédon

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• < 7jours => 5°C+/-3°C
• > 7 jours => – 20°C

Ecouvillon endocervical sans milieu de transport

Frotter énergiquement la muqueuse pdt 10 sec. Ne pas ajouter de liquide.

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• < 7 jours => 5°C+/-3°C
• > 7 jours => – 20°C

Fèces

Lors des prélèvements, ne pas utiliser de lubrifiant, ni de gant avec talc pour prélever

QUANTITE MINIMALE : 10 grammes

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• < 7 jours => 5°C+/-3°C
• > 7 jours => – 20°C

Lait individuel

Utiliser un flacon sans conservateur pour permette un pré-enrichissement avant PCR (recherche d’un portage, analyse après antibiothérapie) ou un typage de souche après PCR positive. L’absence de conservateur impose une transmission rapide de l’échantillon

QUANTITE MINIMALE : 10 ml

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• <48h sans conservateur ou < 7 jours avec conservateur => 5°C+/-3°C
• > 7 jours => congeler à – 20°C

Dans le cas d’un plan de lutte :

• les coupelles ou les flacons doivent être conservées à l’abri de la poussière
• un DAP doit être demandé à l’avance au GDS pour pouvoir identifier les échantillons à l’aide des étiquettes code-barres
• prévenir le LVD 25 tél : 03.81.25.88.50 – mail lvd25@doubs.fr pour définir la date de prélèvement et le nombre approximatif de fèces ou de laits
• le jour des prélèvements, pour les fèces :
  • § ne pas utiliser de lubrifiant, ni de gant avec talc pour prélever les fèces
  • § mettre un échantillon d’environ 20 g dans une coupelle et l’identifier à l’aide des étiquettes code-barres au niveau du fond (et non sur les couvercles qui peuvent être inversés ou sur la face latérale qui ne permet pas de scanner le code).
• Le jour des prélévements, pour le lait:
  • § mettre un échantillon d’environ 20 ml dans un flacon sans conservateur, afin de permettre la mise en place d’une phase de multiplication avant PCR
  • § bien fermer
  • § identifier à l’aide des étiquettes code-barres en long au niveau de la face latérale (et non sur les bouchons qui peuvent être inversés)
• une fois les prélèvements réalisés, les transmettre au LVD 25 au plus vite, afin qu’ils arrivent au plus tard le jeudi avant 15h (les échantillons doivent être pris en charge dès leur arrivée au LVD)

Le respect de ces consignes est nécessaire pour garantir la qualité des analyses.

Prélèvements : Sang total EDTA, Encéphale

C’est le cervelet qui est à privilégier s’il est identifiable, sinon prélever en différents endroits.

Sang total EDTA

DÉLAI MAXIMAL ENTRE PRÉLÈVEMENT ET RÉCEPTION :

• Conservation à 5°C+/-3°C
• Entre Prélèvement et Réception au laboratoire = 5 jours
• Au delà, le prélèvement peut être considéré comme dégradé et le résultat rendu « Sous réserve »

Encéphale

DÉLAI MAXIMAL ENTRE PRÉLÈVEMENT ET RÉCEPTION :

• < 24h max => 5°C+/-3°C> 24h => – 20°C

Dans le cadre des avortements, les pathogènes recherchés par PCR sont :

• Salmonella spp., Listeria monocytogenes
• Coxiella burnetii, Anaplasma phagocytophilum
• Chamydophila spp., virus BoHV4 et Leptospires pathogènes

Placenta

Prendre les cotylédons les plus lésés. Ne pas ajouter de liquide.

QUANTITE MINIMALE : 1 cotylédon

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• < 7 jours => 5°C+/-3°C
• > 7 jours => – 20°C

Mucus vaginal

Prendre les cotylédons les plus lésés. Ne pas ajouter de liquide.

QUANTITE MINIMALE : 2 ml

DELAI MAXIMAL ENTRE PRELEVEMENT ET RECEPTION :

• < 7 jours => 5°C+/-3°C
• > 7 jours => – 20°C